1 背景介紹
感染性疾病是導致人類死亡的首要原因，也是兒童死亡排在第一位的原因，是當之無愧的人類頭號殺手。
全球 | 中國 |
據WHO報道感染性疾病導致患者死亡占全部死因的25%以上 | 感染性疾病占所有疾病的50%以上 |
每年1300萬兒童死于感染性疾病 | 造血系統腫瘤患者75%死于感染 |
| 實體腫瘤患者50%死于感染 |
感染性疾病是人類頭號殺手，是導致兒童死亡第一位原因。抗生素的濫用，使疾病難以控制，也使病原體產生耐藥性，甚至形成超級細菌。
2 病原微生物宏基因組測序（mNGS）介紹
病原學診斷始終是感染性疾病診斷中最重要的環節。傳統的病原學診斷是臨床醫師根據患者的臨床表現做出一系列鑒別診斷，然后針對這些進行檢測，通常一項檢測只能對應一種病原體，而病原微生物宏基因組測序（mNGS）技術檢測能覆蓋更廣范圍的病原體。mNGS，是對患者樣本中微生物和宿主遺傳物質（DNA和RNA）的全面分析。如今它正迅速從科學研究轉向臨床診斷應用，它尤其擅長鑒別罕見、新發、難以檢測和混合感染的病原體。2019年底，我國學者就是借助mNGS技術，僅僅數天時間就確認新冠肺炎是由一種新的冠狀病毒引起的呼吸道傳染性疾病，而2003年確認SARS的病原時，我們用了5個月的時間。如果把傳統針對特定病原的檢測看成是“釣魚”，那么mNGS就類似于“大面積撒網捕撈”。自2008年以來，來自20多個國家的大量研究表明，mNGS應用范圍廣泛，包括病原體檢測鑒定、抗生素耐藥性分析、微生物組分析、抗感染療效評價、人類宿主基因表達轉錄組學和腫瘤學等多個方面。尤其是在診斷不明原因的感染性疾病方面，mNGS表現突出，在藥物敏感性預測中具有巨大潛力，成為優化治療方案和抗菌藥物管理的重要輔助檢測工具。由此，許多醫生認為mNGS是解決臨床感染難題的新利器，有望改變醫生對感染性疾病的診斷和治療實踐。
mNGS檢測技術的特點
傳統的感染性疾病原微生物鑒定方法的主要思路為，先假設、后試驗、再驗證。可以鑒定的微生物種類有限，而不依賴假設的mNGS方法則具有檢測所有種類微生物的潛力。
方法 | 優點 | 缺點 |
PCR檢測 | 簡單、快速、價格低廉，可以定量檢測、準確性高 | 依賴主觀假設，檢測已知的微生物，需要引物擴增，但是引物并不總是可靠，只能檢測微生物基因組的很小一部分 |
培養法 | 可適應較大的樣本體積，價格低廉，“金標準”，研究比較透 | 檢測敏感度受限于培養時抗生素的使用，有些微生物難以培養，無法檢測病毒，檢測周期長 |
質譜法 | 過程簡單，特異性和準確性都很高，可進行高通量分析 ? | 基于已培養的陽性菌落，依賴培養，只能檢測細菌和真菌約1000種已知微生物，部分病原體不能鑒定到種，只能定性而不能定量檢測 |
免疫學檢測 | 時效性強，周期1-3天，價格便宜，操作流程簡單，可檢測支原體、衣原體、病毒等 | 敏感性和特異性差，并不是所有的病原微生物都有相應的抗體，有窗口期、假陽性高 |
mNGS法 | 客觀檢測，不依賴假設、可以檢測任意微生物，可以發現新的病原微生物，可以定量檢測核酸，可以檢測基因組的任一部分 | 檢測結果受宿主背景微生物組成影響，對樣本要求高，易受其他部位的樣本污染，易受環境微生物污染，時效性不如核酸檢測PCR，動輒數千元的檢測價格對于普通家庭屬于高醫療費用 |
tNGS法 | 不受人類基因組及背景菌影響，強化耐藥基因檢測性能，更高的檢測性價比，能夠對低豐度的病原體進行高靈敏度的檢測 | 不能檢測未知微生物 |
mNGS主要應用范圍包括疑似的中樞神經系統（CNS）感染、血流感染、局灶性感染、呼吸系統感染等方面。疑似中樞神經系統感染適用范圍：懷疑CNS急性感染、疑似神經系統病毒感染以及慢性CNS感染和需要隨訪病原學證據的患者。懷疑血流感染適用范圍：血培養3天內陰性且經驗性抗感染治療無效時、原發感染灶病原檢測陰性或因各種因素無法送檢合適標本的情況可考慮送檢血液標本進行病原mNGS。疑似局灶性感染適用范圍：局灶部位在完成常規生化、培養或PCR檢測未能獲取病原學證據時。疑似呼吸道感染適用范圍：3天內未通過傳統檢測獲得明確病原學依據且經驗抗感染無效、高度懷疑病毒性肺炎且病情持續進展，完善呼吸道病毒多重PCR檢測為陰性患者。病原微生物靶向測序（targeted NGS,tNGS）技術將超多重PCR與高通量測序技術相結合，可同時檢測樣本中幾十至幾百種常見病原微生物及其耐藥基因，在提高靈敏度的同時，降低了測序數據量，實現了成本及性能的雙重優化。與mNGS廣覆蓋、無偏倚不同，tNGS利用靶向擴增或捕獲的方式，可用于檢測一組病原體、基因子集或感興趣的特定基因組區域。并且，tNGS所需數據量更小，檢測速度更快，數據分析以及報告生成也更快。今年，《高通量測序技術在分枝桿菌病診斷中的應用專家共識》正式發表，也是首個tNGS相關專家共識。內容涵蓋技術概況、技術特點、臨床適應征和送檢時機、標本采集、臨床結果判讀等五大方面，重點提到了分枝桿菌靶向測序應用于結核/NTM病以及耐藥的診斷優勢，為在分枝桿菌病診斷過程中合理使用高通量測序技術提供參考。
適用人群
精神狀態改變，合并神經系統局部病灶，影像學實質性病灶，腦電圖異常等；
不明原因發熱、膿毒血癥、感染性休克等；
重癥肺炎、肺部陰影、氣管插管、呼吸機等；
胸腔、尿路等其他部位感染。
4.1 血流感染常見病原
CHINET計劃中十家大型教學醫院的血培養樣本的2861個菌株中，排名前10位的病原體是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、鏈球菌、腸桿菌和念珠菌。CABSI（社區獲得性）：大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的流行率高HABSI（醫院獲得性）：肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的比例高ICU患者：鮑曼不動桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌和腸球菌的比例更高
4.2 中樞神經系統感染常見病原
2009年至2018年期間，招募了20,454名急性腦炎腦膜炎患者，9079名病毒感染患者中，28.43%的患者至少有1種病毒檢測呈陽性。18歲以下兒童中最常檢測到的病毒是腸道病毒，18-59歲和≥60歲年齡組中最常檢測到的病毒分別是單純皰疹病毒和乙型腦炎病毒。6802名細菌感染患者中，4.43%的患者至少有一種細菌檢測呈陽性，5歲以下和5-17歲兒童的主要細菌分別是肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌。18-59歲和≥60歲的成年人中最常見金黃色葡萄球菌。
4.3 呼吸系統感染常見病原
2009-2019年全國范圍內全年齡段急性呼吸道感染患者監測結果表明：最常見的病毒病原體為流感病毒（IFV，28.5%），其次為呼吸道合胞病毒（RSV，16.8%）、人鼻病毒 (HRV，16.7%)、人副流感病毒 (HPIV，13.1%)、人腺病毒 (HAdV，10.3%)、人冠狀病毒 (HCoV，5.8%)、人博卡病毒 (HBoV，4.6%)和人偏肺病毒 (HMPV，4.1%)；最常見的細菌為肺炎鏈球菌（29.9%）、肺炎支原體（18.6%）、流感嗜血桿菌（15.8%）、肺炎克雷伯菌（12.5%）、銅綠假單胞菌（11.4%）、金黃色葡萄球菌（8.9%）。對于成年人和老年人，肺炎的病原體譜與非肺炎僅略有不同。
tNGS和mNGS各有優勢和局限性，它們在不同的場景下有著不同的適用性。tNGS的優勢是能夠對低豐度的病原體進行高靈敏度的檢測，同時降低測序數據量和分析工作量，提高檢測效率和成本效益；但是tNGS的局限性是只能檢測預先設計好的病原體，無法發現新型或罕見的病原體，也無法對病原體進行全基因組分析。mNGS的優勢是能夠對樣本中的所有病原體進行無偏向的檢測，發現新型或罕見的病原體，同時提供病原體的全基因組信息，有利于溯源、分型和耐藥評估等；但是mNGS的局限性是需要較大的測序數據量和分析工作量，檢測成本和時間較高，對低豐度的病原體檢測靈敏度較低。因此，tNGS和mNGS并不是相互替代的關系，而是相互補充和協同的關系。在臨床微生物學領域，tNGS更適合于常見或已知病原體的快速篩查和診斷，而mNGS更適合于未知或罕見病原體的探索和鑒定。兩種技術結合使用，可以實現更全面、更準確、更高效的病原體檢測。
[1].?Itai Sharon and Jillian F. Banfi eld. Genomes from Metagenomics.?Science, 2013, 342: 1057-1058.[2]. Wei Gu et al. Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen DetectionAnnu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2019. 14:317–36.[3]. Michael R. Wilson et al. Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing.?N Engl J Med,?2014, 370:2408-17.[4]中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識.[J]中華傳染病雜志.2020.[5]宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病病原檢測中國專家共識.[J]中華檢驗醫學雜志.2021.[6]宋振舉等.宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識[J].中華急診醫學雜志,2019.
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