1?基因組和基因測序
根據人類基因組計劃（The Human Genome Project）估計，人類擁有20000-25000個蛋白編碼基因。基因組（genome）指一個生物體所包含DNA的全部遺傳信息。基因組由基因區域和非編碼區域組成。人類的基因組大小約為30億個堿基對（bp）（3GB），其中非編碼區域占到絕大多數，編碼蛋白質的區域僅占約2%左右。
外顯子是基因組中能夠轉錄組出成熟RNA的部分。一個基因組中所有外顯子的集合，即為外顯子組（exome）。人類擁有約18萬個外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬個bp（30MB）。通常所說的全外顯子組測序，是指針對蛋白編碼基因的外顯子，很少涉及非編碼基因。
基因（gene）是DNA中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段，是控制生物性狀的基本遺傳單位。人類基因區間的大小可從數百個bp至超過200萬個bp不等。
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圖：蛋白編碼基因由內含子（非編碼序列）和外顯子（包括編碼序列以及UTR區域）組成。要翻譯有功能的蛋白，要進行以下步驟：基因從DNA轉錄為RNA前體，通過剪接形成成熟RNA，成熟RNA序列翻譯成氨基酸鏈，以及蛋白質分子的翻譯后修飾。圖源：https://www.britannica.com/science/gene
關于外顯子，需要注意的一個特殊情況是非翻譯區（UTR）。在mRNA的兩側分別存在5'UTR（前導序列）和3'UTR（尾部序列），它們的作用分別是調控翻譯的啟動和終止。它們由外顯子序列構成，但不會被翻譯成氨基酸。所以，并非所有外顯子序列都會被翻譯成氨基酸。
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圖：信使RNA前體（pre-mRNA）中的外顯子。外顯子既包括編碼氨基酸的序列（紅色），也包括不被翻譯的序列（灰色）。?圖源：https://en.wikipedia.org/wiki/Exon
2?全外顯子測序
2.1?簡介
對外顯子組（基因組里的所有外顯子）進行測序的方法，即為全外顯子組測序（Whole-Exome Sequencing，WES），也稱為外顯子組測序、全外顯子測序，全外測序等。全基因組測序（Whole-Genome Sequencing，WGS）是對整個基因組進行測序。靶向測序（Targeted-sequencing，也稱Panel sequencing）是對選定的基因進行測序，通常有幾十個至一千個基因不等。因而，從覆蓋基因組的范圍來說，全基因組測序>全外顯子組測序>靶向測序。全外測序可以視作一種特殊的靶向測序——它靶向的區域是基因組上的所有外顯子。打個比喻：我們去菜市場買菜，菜市場里有豐富多樣的瓜果蔬菜肉類（WGS），任君挑選。我們一般會根據自己的喜好需求挑選自己喜歡的（WES或者其他定制化panel），如果我們能確定吃飯的客人的喜好，那我們可以直接選擇對應的菜品（定制化panel），如果我們不確定客人的喜好，或者吃飯的人多，那我們可能要多選一些菜品，做一大桌，客人喜歡哪個就吃哪個（WES）。
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| SNPs、InDels、CNV、Fusion、SV | | |
(1)SNP: single nucleotide polymorphism，單核苷酸變異；
(2)InDels:insertions,deletions，小片段插入缺失；
(3)CNV:copy-number variations，拷貝數變異；
(4)Fusion:基因融合；
(5)SV:Structural Variants，結構變異，常指的是那些在染色體水平發生了較大片段（大小至少為50 bp）的變異 |
2.2?WES的優勢
科學家們可以選擇全基因組測序（WGS）或一種更有針對性的方法，只關注外顯子，即全外顯子測序（WES），和WGS相比，WES在以下三個方面具有優勢(1)時間：與WGS相比，進行WES需要的時間更少；(2)數據：與WGS相比，WES產生的數據集要小得多，對于生物信息學分析來說更容易管理；2.3?WES技術適用的臨床人群
??具有非典型性疾病特征，或經過多種醫學檢測未查明致病原因的患者。??涉及某一臟器或多臟器綜合征的、臨床表型提示涉及單基因疾病的患者。??不明原因體格發育遲緩、智力發育遲緩、多神經發育異常、精神狀態異常的患者。
2.4?WES的應用方向
人類全外顯子組所占基因組比例不超過2%，但它包含了約85%與疾病相關的變異，因此在研究編碼基因變異層面，全外測序是比全基因組測序更為經濟高效的替代方法。全外測序適用于孟德爾疾病、腫瘤、復雜疾病等多個研究領域。對于表現出異質性的疾病，或者患者表現出多個系統受累的復雜疾病癥狀時，尤為適合使用全外測序。?
圖：外顯子組僅占整個基因組的不到2%。圖源：https://www.my46.org/intro/whole-genome-and-exome-sequencing
由于外顯子組僅占基因組的不到2%，WES相比于WGS，能夠減少測序費用、提高測序深度、縮短測序周期，從而以更低的成本檢測到更多的低頻變異。而相對于panel測序，WES有著廣闊得多的覆蓋范圍。（1）例如在腫瘤臨床檢測中，尋求肺癌靶向治療的患者通常會先做panel測序，因為與肺癌靶向治療相關的基因是比較明確的，幾十至一百多個基因的panel測序通常就可以滿足需求。（2）而對于尋求免疫治療的患者，通常會使用全外或大panel測序，來評估腫瘤突變負荷（Tumor Mutational Burden, TMB），TMB高的患者通常對免疫治療有更好的響應。全外測序是業內公認的評估TMB的金標準。（3）在腫瘤方面，除臨床檢測外，WES也適用于類似繪制突變圖譜、探索耐藥機制這樣的研究場景。（4）全外測序也適用于遺傳疾病檢測。遺傳疾病，尤其是單基因遺傳病（又稱孟德爾疾病），種類多，涉及的基因也多。在OMIM數據庫中收錄的單基因疾病已有超過5000種，相關基因已有近4000個。如果要進行一次全面的單基因遺傳病的篩查，全外無疑是全面、方便、合適且具性價比的選擇。（5）如果我們只想檢測常見的某十幾種遺傳病，定制panel來進行檢測也是可行的，但全外無疑會更具研究價值。隨著新的疾病及其分子機制被不斷揭示，需要加入解讀列表的基因會越來越多。如果某人接受過全外檢測，數年后他想看看自己有沒有攜帶新發現的致病突變，那么他只需要帶著檢測數據請一位遺傳咨詢師為他解讀就可以了，而不用再做一次檢測。從這個角度來說，全外從長遠來看也是更具性價比的。2.4.1 WES應用于孟德爾遺傳疾病
人體基因組中直接參與蛋白質編碼的區域稱為外顯子。人類外顯子組序列包括22000多個基因的180000多個外顯子，雖然僅占人類全基因組的1-2%，但約85%的疾病相關遺傳突變都在這個區域，涵蓋了與個體表型相關的大部分功能性變異。2.4.2?WES應用于產前診斷
研究發現，在妊娠過程中，大約2%～4%的胎兒存在明顯的結構異常，目前常用的染色體核型分析和染色體拷貝數分析技術只能為20%左右的這類胎兒提供診斷，還有一半以上的病例未能得到有效的診療。大規模的前瞻性研究表明，在染色體核型和染色體拷貝數分析均未見異常的胎兒中，產前WES可將結構異常胎兒的診斷率提高8.5%～10%。而且單基因變異在嬰幼兒期疾病中的占比較高，因此產前WES對于部分嚴重先天性疾病在孕期的診斷可能發揮重要的作用。2.4.3?WES應用于癌癥研究
WES是對基因組外顯子以及周邊區域DNA進行富集捕獲，然后利用二代測序獲得序列信息，最后結合外顯子公共數據庫和生信分析方法來解釋變異與疾病之間關聯的一種技術。同時WES容易實現大于100X的測序深度，因此WES是高效的發現人類疾病信息的研究手段。目前WES技術已被廣泛應用在多個方面，其中癌癥研究是最熱門、最復雜、也是全人類最想攻克的難題。下圖是研究腫瘤外顯子的14個分析內容，左邊是比較常見的分析點，右邊是比較新穎的分析點，如突變特征分析、腫瘤突變負荷分析（TMB）、雜合性缺失分析（LOH）、同源重組缺陷分析（HRD）、微衛星不穩定分析（MSI）、新抗原變異分析（HLA）。2.5?WES的局限性
首先，WES對于涉及拷貝數變異、非編碼區變異和結構變異的疾病研究不適用。其次，在對目標區域進行捕獲時，存在捕獲不均、捕獲偏差等現象，可通過增加測序深度，獲得更多的序列信息進行統計分析，盡可能彌補這些偏差。3?檢測項目介紹
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| 檢測先證者(有癥狀)及其父母樣本中核基因組的20000多個基因以及先證者線粒體基因組，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV。家系全外相較于單人全外能有效排除可能遺傳自父母的非致病位點，更方便分析新發變異 | 輔助醫生進行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者（有癥狀）樣本中核基因組的20000多個基因以及線粒體基因組，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV，并通過一代測序進行父母樣本的疑似致病SNV/Indel變異的驗證 | 輔助醫生進行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者（有癥狀）樣本中核基因組的20000多個基因，檢測變異類型包括SNV、Indel和CNV，并通過一代測序進行父母樣本的疑似致病SNV/Indel變異的驗證 | 輔助醫生進行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
| 檢測先證者(有癥狀)及其父母樣本中核基因組的20000多個基因，檢測變異類型包括SNV、lndel和CNV。家系全外相較于單人全外能有效排除可能遺傳自父母的非致病位點，更方便分析新發變異。 | 輔助醫生進行罕見病、疑難病臨床診斷或輔助排除遺傳因素 |
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參考資料：
1.https://www.my46.org/intro/whole-genome-and-exome-sequencing.
2.https://en.wikipedia.org/wiki/Exon.
3.https://www.britannica.com/science/gene.
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